Montag, 27. Juni 2011

Mikrobiologische Informationen 7.

Nährmedienherstellung
  • Autoklav: 121°C 15 Min.
  • Dampftopf: 98°C 30 Min. (z. B. bei VRBD)
  • Trockensterilisator: 180°C 2 Std.
    • Trockensterilisation für z. B. Spatel, Glasröhrchen

  • Entsorgung → im Plastikbeutel autoklavieren bei 124°C für 20 Min.

Für die Nährmedienherstellung wird entmineralisiertes Wasser verwendet.

Gelatine wird nicht gerne verwandt, da die meisten MO’s Gelatinase bilden.

Einmal verfestigter Agar wird ab 100°C flüssig.

quantitative Nachweise: Membranfiltration, Spatel-, Tropfplatten-, Gussplattenverfahren

Laborsicherheit
  • Baumwollkittel
    • lange Arme
    • kniebedeckend
  • festes, trittsicheres Schuhwerk
  • Staubmaske beim Einwiegen
  • Thermohandschuhe beim Anfassen von heißen Gegenständen
  • Schutzbrille bei pH-Wert-Einstellung
  • Pipettierhilfen verwenden
  • nicht essen und trinken
  • Speisen und Getränke nicht in Laborgefäßen / -geräten aufbewahren
  • Garderobenschrank benutzen

Mikroskop
Methylenblaufärbung
  1. Einen Tropfen NaCl-Lsg. (0,90%ig) auf Objektträger geben und mit ausgeglühter Impföse Kultur im Tropfen verreiben. Trocknen lassen und hitzefixieren!
  2. Mit Methylenblaulösung 3 Min. bedecken.
  3. Mit Leitungswasser gut abspülen.
  4. Mit Filterpapier abtupfen und trocknen.
  5. Mikroskopieren 400fach ohne Deckglas, 1000fach ohne Deckglas, mit Öltropfen.
  6. Ziel: Sind MO’s vorhanden od. nicht!
Sporenfärbung
  1. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren.
  2. 3 Min. mit Malachitgrün bedecken.
  3. Abgießen und mit Wasser abspülen.
  4. 30 Sek. mit Safraninlsg. bedecken.
  5. Mit Leitungswasser abspülen.
  6. Mit Filterpapier abtupfen und trocknen.
  7. Mikroskopieren, 400fach ohne Deckglas, 1000fach ohne Deckglas, mit Öltropfen.
  8. Ziel: Erkennen ob Sporen- / bildner vorhanden sind → Spore grün, Zelle rot.

Gramfärbung
  1. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren.
  2. 1 Min. mir Kristallviolett bedecken.
  3. Abgießen und mit Wasser nachspülen.
  4. 1 Min. Lugolsche Lösung einwirken lassen.
  5. 1-2 Sek. in 96%igen Ethanol tauchen.
  6. Mit Alkohol abspülen, bis keine blauen Farbwolken mehr sichtbar sind.
  7. Mit Wasser nachspülen.
  8. 15 Sek. Karbolfuchsin einwirken lassen.
  9. Mit Wasser abspülen.
  10. Mit Filterpapier abtupfen und trocknen.
  11. Mikroskopieren, 400fach ohne Deckglas, 1000fach ohne Deckglas, mit Öltropfen.
  12. Ziel: Gram positive blau, Gram negative rot.

Hängender Tropfen
  1. Kleine Menge Vaseline an den Enden des Deckelglases auftragen.
  2. Tropfen Bouillonkultur in die Mitte des Deckelglases geben.
  3. Hohlschliffobjektträger auflegen. Der Tropfen muß in den Hohlschliff ragen.
  4. Objektträger umdrehen, Tropfen hängt im Hohlschliff.
  5. Tropfenrand beim Mikroskopieren in die Mitte des Blickfeld ziehen, abblenden, 400fache Vergrößerung
  6. Ziel: Nachweismethode zur Beweglichkeit.

Stichkultur
  1. Impfnadel ausglühen.
  2. Mit der Nadel Probe aus Kolonie entnehmen.
  3. Mit der Impfnadel bis fast zum Boden des Reagenzglases (halbfester Agar 0,3%) einstechen.
  4. Impfnadel ausglühen.
  5. Bebrütung.
  6. Ziel: Nachweis zur Beweglichkeit.

Mikroskopische Zellzahlbestimmung (Zählkammer)
  • Nährbouillon aufschütteln (10% der Keime sind tot)
  • Mit Impföse Tropfen auf den mittleren Steg geben
  • Deckglas über die drei Stege legen und fest andrücken
  • Überschüssige Flüssigkeit sammelt sich in der Rinne
  • Bei 400facher Vergrößerung mikroskopieren
  • Mindestens 8 Großquadrate (16 x 8 Kleinquadrate) auszählen
  • Mittelwert bilden
  • MO pro ml berechnen
  • Bei Neubauer-Kammer N mit Faktor 10 multiplizieren
  • Ziel: Thomakammer → Zählung von Blutkörperchen oder Hefen
Neubauerkammer → Zählung von Bakterien
fraktionierter Ausstrich
  1. Mit ausgeglühter und erkalteter Impföse Probe aus Nährbouillon entnehmen.
  2. Menaderförmig auf 1. Drittel der Nähragarplatte ausstreichen.
  3. I
    mpföse ausglühen und erkalten lassen.
  4. Öse senkrecht durch den vorherigen Ausstrich führen.
  5. Öse auf dem 2. Drittel meanderförmig ausstreichen.
  6. Impföse ausglühen und erkalten lassen.
  7. Öse senkrecht durch den 2. Ausstrich führen.
  8. Öse auf dem 3. Drittel meanderförmig ausstreichen.
  9. Öse ausglühen.
  10. Bebrütung.
  11. Ziel: Gewinnung einer Reinkultur.

Verdünnungsreihe
  1. Vier sterile Reagenzgläser mit 9 ml steriler Verdünnungsflüssigkeit befüllen.
  2. Röhrchen beschriften (VD 10-1 bis 10-4)
  3. Nährbouillon gut aufmischen.
  4. 1 ml Suspension mit einem Halm entnehmen und in das erste Reagenzglas überführen.
  5. Reagenzglasinhalt gut durchmischen.
  6. Mit einem neuen Halm 1 ml der VD-Stufe 10-1 in das nächste Reagenzglas überführen.
  7. Bis zur VD-Stufe 10-4 so weiter verfahren.


Tropfplattenverfahren
  1. Petrischale mit Nähragar beschriften. Endverdünnung beachten.
  2. Auf dem Boden die Beimpfungsfelder einzeichnen.
  3. P
    latte mit Deckel nach oben auf den Tisch legen.
  4. Mit sterilem Halm 0,1 ml aus der höchsten VD in das entsprechende Feld pipettieren und verteilen.
  5. Mit dem selben Halm aus der nächst niedrigen VD 0,1 ml entnehmen und wie oben beschrieben verfahren, usw.
  6. Platten so lange stehen lassen, bis die Flüssigkeit in den Agar eingezogen ist.
  7. Platte mit Deckel nach unten bebrüten.
  8. Ziel: Einsparung von Petrischalen.


Spatelverfahren
  1. 4 Petrischalen auf dem Boden beschriften.
  2. P
    latten mit Deckel nach oben auf den Tisch stellen.
  3. Mit sterilem Halm 0,1 ml aus der höchsten VD entnehmen und auf die entsprechende Platte geben.
  4. Mit dem selben Halm aus der nächst niedrigern VD 0,1 ml entnehmen und auf die entsprechende Platte geben, usw.
  5. Nach der Beimpfung mit dem Drigalskispatel die am höchsten verdünnte Probe auf dem gesamten Agar verteilen, bis der Spatel nicht mehr widerstandsfrei gleitet.
  6. Den selben Spatel für die nächst niedere VD verwenden, usw.
  7. Platten so lange stehen lassen, bis die Flüssigkeit in den Agar eingezogen ist.
  8. Platte mit Deckel nach unten bebrüten.
  9. Ziel: Herausfinden der KBE’s im Produkt

Plattenguss
  1. 4
    Petrischalen auf dem Boden beschriften. Endverdünnung beachten!
  2. Platten mit Deckel nach oben auf den Tisch stellen.
  3. Mit einem sterilen Halm 1,0 ml aus der höchsten VD entnehmen und auf die entsprechende Platte geben.
  4. Mit dem selben Halm aus der nächst niederen VD 1,0 ml entnehmen und wie oben beschrieben verfahren, usw.
  5. Wenn alle Platten beimpft sind, flüssigen Agar in die Petrischalen gießen und vorsichtig schwenken, damit sich die Probe vermischt.
  6. Platte stehen lassen, bis der Agar fest ist.
  7. Platte mit Deckel nach unten bebrüten.
  8. Ziel: Herausfinden der KBE’s im Produkt

Membranfiltration
  1. Nähragarplatte auf dem Boden beschriften.
  2. Filtrationsgerät an Absaugflasche befestigen. Über Wouffsche Flasche an Vac.pumpe anschliessen.
  3. Mit steriler Pinzette sterilen Membranfilter (0,45 μm) auf sterile Filtergritt auflegen.
  4. Filtertrichter aufsetzen und Hebelverschluss schliessen.
  5. Bakteriensuspension (< 10 KbE/ml) in Trichter geben.
  6. Vac.pumpe einschalten, Hahn öffnen, Probe filtrieren.
  7. Hahn schließen, Filtertrichter abnehmen, Filter mit steriler Pinzette auf Agar legen.
  8. Bebrütung.
  9. Ziel: Für alle filtrierbaren LM in großen Mengen, wo Keimzahlen < 10 KbE erwartet werden.


KOH-Test
  1. Einen Tropfen KOH 3%ig auf den Objektträger geben.
  2. Mit der ausgeglühten Impföse eine Kolonie in den KOH-Tropfen geben.
  3. 30 Sekunden verrühren.
  4. Die Impföse vorsichtig hochheben.
  5. Ist ein leichter Schleimfaden zu sehen, so ist das Bakterium als Gram negativ anzusehen.
  6. Ist kein Faden zu sehen, so ist das Bakterium als Gram positiv anzusehen.
  7. Ziel: Unterscheidung zwischen Gram positiv und Gram negativ.

Katalase-Test
  1. Einen Tropfen H2O2 3%ig auf den Objektträger geben.
  2. Mit der ausgeglühten Impföse eine Kolonie in den Tropfen geben.
  3. Schäumt die Probe, so ist das ein Zeichen für ein Bakterium, daß aerob oder auch fakultativ anaerob ist.
  4. Schäumt die Probe nicht, so ist es sehr wahrscheinlich ein anaerobes Bakterium.
  5. Ziel: Unterscheidung zwischen aerob / faklutativ anaerob und anaerob.

Oxidase-Test
  1. Oxidasetestreifen auf den Objektträger legen.
  2. Mit Plastikimpföse!! Kolonie auf den Teststreifen geben.
  3. Bei sofortiger Blaufärbung ist die Probe Oxidase positiv, also aerob.
  4. Bei verzögerter Blaufärbung negativ, also fakultativ anaerob oder anaerob.
  5. Ziel: Unterscheidung zwischen aerob und fakultativ anaerob / anaerob.

OF-Test
  1. Impfnadel ausglühen.
  2. Impfnadel mit Kolonie inkubieren.
  3. Mit geradem Stich jeweils zwei Reagenzgläser mit halbfestem, blau-türkisem Medium beimpfen.
  4. Ein Reagenzglas, für die anaerobe Bebrütung, mit Paraffin verschließen.
  5. Bebrüten.
  6. Auswertung: Keine Farbveränderung → die Glucose wurde nicht verstoffwechselt
Gelbfärbung → Glucose wurde oxidativ bzw. fermentativ zu Pyruvat und verschiedenen Säuren verstoffwechselt.
  1. Ziel: Untscheidung zwischen aerob, anaerob und Glucoseverstoffwechselung.

Säurebildung aus KHD’s
  1. Mit zuvor ausgeglühter Impföse Kulturmaterial in Bouillon (lila) überführen.
  2. Nicht mischen → es darf keine Luft in das Durhamröhrchen gelangen.
  3. Reagenzglas veschließen.
  4. Bebrüten.
  5. Auswertung: Kein Farbumschlag, keine Gasbildung → Lactose wurde nicht zu Säure
+ ß-Galaktosidase verstoffwechselt.
Farbumschlag + Gasbildung → ß-Galaktosidase wurde gebildet und somit Säure + Gas.
  1. Ziel: Erkennen von ß-Galaktosidase- und Gasbildung

VP-Test
  1. Mit zuvor ausgeglühter Impföse Probe in MR-VP-Bouillon (hellgelb, wie Apfelsaft) überführen.
  2. Gut durchmischen.
  3. Bebrüten.
  4. Bei Bodensatz: 10 Tropfen 40%ige KOH dazugeben.
  5. Gut durchmsichen.
  6. 5 Tropfen Barrit-Reagenz (-naphtol) dazugeben.
  7. Über 15 Min. immer wieder gut durchmischen, damit O2 in die Probe gelangt.
  8. Bei schwach rötlicher Färbung gilt der Test als Nachweis für Diacetyl, gebildet aus Glucose und Acetoin. → E.coli
  9. Ziel: Nachweis von Diacetyl durch Verstoffwechselung von Glucose zu Acetoin zu Diacetyl → E.coli

SIM-Agar
  1. Mit zuvor ausgeglühter Impfnadel Bouillonkultur aufnehmen.
  2. Im halbfestem Medium (hellgelb) Stichbeimpfung durchführen.
  3. Bebrüten.
  4. Auswertung:
    1. Verstoffwechselung von Sulfat und Eisen zu Einsensulfid → Schwarzfärbung. Ist das Medium über den Stich hinaus schwarz, ist dies ein Beweis für Mobilität.
    2. 2 Tropfen Indolreagenz auf die Probe geben. Bei der Bildung von Indol aus Tryptophan, bildet sich ein roter Ring → Indol positiv
  5. Ziel: S: Schwarzfärbung durch Sulfid I: Indoltest M: Mobilitätstest

Ornithindecarboxylase
      1. Mit zuvor ausgeglühter Impföse Kultur aufnehmen.
      2. Bouillon (lila) beimpfen und gut durchmischen.
      3. Bebrüten.
      4. Bei Gelbfärbung wurde Glucose verstoffwechselt.
      5. Bei schwacher Lilafärbung wurde die AS Ornithin zusätzlich verstoffwechselt.
      6. Ziel: Test auf Verstoffwechselung von Glucose und Ornithin.

Bunte Reihe
  • OF-Test, Säurebildung aus KHD’s, VP-Test, SIM-Agar, Ornithindecarboxylase

Gewogenes arithmetisches Mittel

C gew. arithmetisches Mittel der Koloniezahl
∑C Summer der Kolonien, die zur Berechnung herangezogen werden
n1 Anzahl Petrischalen / Felder der niedrigsten auswertbaren VD
n2 Anzahl Petrischalen der nächst höheren VD
d Faktor der niedrigsten auswertbaren VD, auf die VD von n1 bezogen


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